產(chǎn)品名稱(chēng):：線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品英文名:  Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅤActivity Assay Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：BC1440               產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷8三樓

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣           產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            參考價(jià)格：2600
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨                          
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簡(jiǎn)要介紹：
線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅴ又稱(chēng)F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線(xiàn)粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
    復(fù)合體Ⅴ水解ATP 產(chǎn)生ADP 和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi 增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。


產(chǎn)品詳細(xì)描述
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體15mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；
試劑二： 粉劑×1支，-20℃保存；臨用前每支加入1.11mL雙蒸水，充分溶解備用，分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水，充分混勻；
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL雙蒸水，充分混勻；
試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL雙蒸水，充分混勻；
試劑七：液體10mL×1 瓶，室溫保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1 支，4℃保存。10μmol/mL磷標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前用蒸餾水稀釋40倍即0.25μmol/mL 磷標(biāo)準(zhǔn)液。
定磷試劑的配制：按H2O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。
注意：配試劑用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
 
產(chǎn)品說(shuō)明：
線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅴ又稱(chēng)F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線(xiàn)粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、復(fù)合體Ⅴ的提取：   

• 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 4 ℃ 600 g離心10min。
• 將上清液移另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心15min。
• 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線(xiàn)粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做，可以判斷線(xiàn)粒體提取效果）。
• 在沉淀中加入400uL提取液，超聲波破碎（功率20％，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。

二、測(cè)定步驟：

1. 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)660nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 操作表：

（1）酶促反應(yīng)

（2）定磷

混勻，40℃水浴10min，盡快在660nm測(cè)定吸光值，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。

三、復(fù)合體Ⅴ活力單位的計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。
復(fù)合體Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)×V酶促×1000÷（Cpr×V樣品）÷T
=20×ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr。
C標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.25μmol/mL； 1000：1μmol=1000nmol；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL，需自行測(cè)定，推薦我公司BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒；V樣品：樣品體積，0.2mL；V酶促，酶促反應(yīng)總體積，0.48mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2 小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度；若ΔA偏小，則可以通過(guò)增加加入的樣品體積來(lái)提高靈敏度。
2. 由于提取液中含有蛋白，所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測(cè)量）。
3. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應(yīng)。
4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（檢測(cè)樣本數(shù)為50T/24S）

A、上清中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA1×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA1÷W
ΔA1：上清測(cè)定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL。 w：樣本重量，g。T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；
B、沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測(cè)定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，8.4×10^-4 L；ε：細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V提取：加入提取液體積，0.4mL。 w：樣本重量，g。T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；
C、樣本復(fù)合體Ⅳ總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅳ總活力即為上清中復(fù)合體Ⅳ活力與沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力之和。
按樣本鮮重計(jì)算：
復(fù)合體Ⅳ（U/g）=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W

相關(guān)文獻(xiàn)：
《A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum》 作者:Qiuli OuYang, Nengguo Tao* and Miaoling Zhang 期刊:Frontier in Immunology 影響因子:4.259 PMID:29503638
《Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke -induced airway epithelial cell injury model》 作者:Muyun Wang,Yanbei Zhang,Mengmeng Xu,HaiZhang,Yuqing Chen,Kian Fan Chung,Ian M.Adcock,Feng Li 期刊:Free Radic. Biol. Med. 影響因子:5.657 PMID:30639616


 

線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測(cè)試劑盒